แบบจำลองความเป็นพิษของวัสดุนาโน : วัสดุนาโนสามารถดัดแปลงดีเอ็นเอโดยตรง และชักนำให้เกิดการกลายพันธุ์ได้

5 กันยายน 2559

 

            จากพัฒนาการที่รวดเร็วอย่างมีนัยสำคัญ จากความก้าวหน้าและผลประโยชน์ที่ได้รับจากวัสดุนาโน (nanomaterials) และเทคโนโลยีนาโน (Nanotechnology) ส่งผลให้ความเป็นพิษของวัสดุนาโนเริ่มถูกนำมาศึกษาวิจัย จนเกิดมีวิชาใหม่ขึ้นที่ชื่อว่า Nanotoxicology ในช่วงทศวรรษที่ผ่านมามีการค้นพบและพิสูจน์ทราบความเป็นพิษของวัสดุนาโนในหลายกรณีด้วยกัน ความเป็นพิษดังกล่าวควรได้รับการใส่ใจเป็นพิเศษสำหรับการบำบัดรักษาด้วยการส่งถ่ายยีนที่ใช้วัสดุนาโนเป็นสื่อกลาง (nanomaterial-mediated gene therapy) เพราะเมื่อดีเอ็นเอเกิดไปอยู่ติดกับวัสดุนาโน จะเกิดมีอันตรกิริยาระหว่างกัน ผลของอันตรกิริยาที่มีต่อดีเอ็นเอควรจะได้รับการพิสูจน์ทราบ มิฉะนั้นแล้วอาจกลายเป็นการใช้งานยีนที่ถูกดัดแปลงไปแล้วโดยรู้เท่าไม่ถึงการณ์

 

            ในการศึกษาของเรา ได้นำวัสดุนาโนไปสัมผัสโดยตรงกับดีเอ็นเอตัวเปล่าและทำการเพาะเลี้ยงส่วนผสมนี้ หลังจากนั้นดีเอ็นเอถูกนำไปวิเคราะห์รูปแบบของโครงสร้างที่เปลี่ยนไป นอกจากนั้นดีเอ็นเอที่สัมผัสกับวัสดุนาโนมาแล้วได้ถูกส่งถ่ายเข้าสู่เซลล์แบคทีเรีย เพื่อศึกษาการกลายพันธุ์ สำหรับเซลล์ที่เกิดการกลายพันธุ์ ดีเอ็นเอจะถูกสกัดออกมา แล้วนำไปวิเคราะห์ด้วยวิธี Gel Electrophoresis  เพื่อศึกษาการถูกทำลายของดีเอ็นเอ และใช้การหาลำดับเบสดีเอ็นเอศึกษาชนิดของการกลายพันธุ์

 

             เพื่อการสังเกตผลที่เกิดขึ้นจากระบบที่ง่ายที่สุด และมีโอกาสเกิดขึ้นได้มากที่สุด การสัมผัสกันระหว่างดีเอ็นเอตัวเปล่ากับวัสดุนาโนเป็นแบบตรงไปตรงมา ไม่มีการเสริมด้วยสิ่งกระตุ้นใดๆ โดยจัดให้อยู่ในสิ่งแวดล้อมที่ต่างกัน 2 สถานะคือ แห้งกับเปียก สถานะเปียกเป็นสิ่งแวดล้อมปกติของการสัมผัสกันระหว่างดีเอ็นเอกับวัสดุนาโน เพราะโดยทั่วไปดีเอ็นเอจะอยู่ในเซลล์ชีวภาพ แต่เพื่อความชัดเจน สิ่งแวดล้อมแบบแห้งที่มีแต่วัสดุนาโนกับดีอ็นเอได้ถูกใช้ในการทดลองด้วย

 

            วัสดุนาโนที่ใช้ในการศึกษานี้มีอยู่ 2 ชนิดคือ ท่อนาโนคาร์บอน (carbon nanotube หรือ CNT) และแผ่นนาโนทังสเตนไตรออกไซด์ (tungsten trioxide (WO3) nanoplates) ดังแสดงในรูปที่ 1 ที่ถูกสังเคราะห์ขึ้นจากห้องปฏิบัติการวิจัย 2 แห่งของภาควิชาฟิสิกส์และวัสดุศาสตร์ คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยเชียงใหม่

 

 

 

รูปที่ 1 ภาพถ่ายด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนของ (ซ้าย) ท่อนาโนคาร์บอน และ (ขวา) แผ่นนาโนทังสเตนไตรออกไซด์

 

 

             พลาสมิด pGFP (พลาสมิดที่มีโปรตีนเรืองแสงสีเขียว) ซึ่งเป็นโมเลกุลดีเอ็นเออย่างง่ายที่มักจะถูกใช้เป็นดีเอ็นเอจำลองในการศึกษาทางชีววิทยา ได้ถูกใช้ในการทดสอบกับวัสดุนาโนทั้ง 2 ชนิดข้างต้น

 

             การสัมผัสกันระหว่างวัสดุนาโนกับดีเอ็นเอตัวเปล่าทำที่อุณหภูมิห้อง ใช้ช่วงเวลาของการผสม 5 ช่วงคือ 3, 6, 12, 24 และ 48 ชั่วโมง ดีเอ็นเอถูกส่งถ่ายเข้าสู่เซลล์ของแบคทีเรีย E. coli โดยใช้วิธี Electroporation   ดีเอ็นเอที่ถูกสกัดออกมาจากเซลล์ที่เกิดการกลายพันธุ์จะถูกนำไปหาลำดับเบสดีเอ็นเอ

 

 

 

รูปที่ 2 ลายพิมพ์ดีเอ็นเอของพลาสมิดหลังการผสมกับท่อนาโนคาร์บอน (CNT) ปริมาณ ไมโครกรัม (อัตราส่วนของมวล CNT / DNA = 1/100)  เป็นเวลานาน 3 ชั่วโมง [ดูที่รูป(a)]  6 ชั่วโมง [ดูที่รูป(b)]  12 ชั่วโมง [ดูที่รูป(c)]  24 ชั่วโมง [ดูที่รูป(c)] และ 48 ชั่วโมง [ดูที่รูป(d)]  แถวที่ และ ของทั้ง 4 รูปมาจากโมเลกุลเครื่องหมาย (100 bp) และจากพลาสมิดที่ยังไม่ได้ผสมกับ CNT (control) ส่วนแถวอื่นๆที่เหลือมีคำอธิบายดังนี้ รูป(a) : แถว และ คือการผสมแบบแห้ง ชั่วโมง แถว คือการผสมแบบเปียก ชั่วโมง รูป(b) : แถว และ 4 คือการผสมแบบแห้ง ชั่วโมง แถว คือการผสมแบบเปียก ชั่วโมง  รูป(c) : แถว คือการผสมแบบแห้ง 12 ชั่วโมง แถว คือการผสมแบบเปียก 12 ชั่วโมง แถว คือการผสมแบบแห้ง 24 ชั่วโมง แถว คือการผสมแบบเปียก 24 ชั่วโมงชั่วโมง  รูป(d) : แถว คือการผสมแบบแห้ง 48 ชั่วโมง แถว คือการผสมแบบเปียก 48 ชั่วโมง โดย และ หมายถึงโครงสร้างของดีเอ็นเอแบบ supercoil กับแบบ relax ตามลำดับ

 

การจำแนกขนาดของดีเอ็นเอใช้วิธี Gel Electrophoresis ได้ผลดังแสดงในรูปที่ 2 ความเข้มของแถบสว่างเป็นตัวแทนของจำนวนดีเอ็นเอที่มีโครงสร้างแบบหนึ่งๆ การลดลงของดีเอ็นเอที่มีโครงสร้างดั้งเดิมแบบ supercoil ในขณะที่โครงสร้างดีเอ็นเอแบบ relax  มีจำนวนเพิ่มขึ้นนั้น บ่งชี้ว่าการเกิดการขาดของสายใดสายหนึ่งของดีเอ็นเอ (single-strand break              หรือ SSB) มีโอกาสสูง และสิ่งแวดล้อมที่เปียกมีอานุภาพทำให้สายดีเอ็นเอขาดสูงกว่าในการผสมกันแบบแห้ง

 

เราพบว่าจำนวนของโครงสร้างดีเอ็นเอแบบ supercoil ที่มีอยู่และโครงสร้างดีเอ็นเอแบบ relax ที่เกิดขึ้นสามารถแทนได้ด้วยสมการทางคณิตศาสตร์ง่ายๆ ดังต่อไปนี้

 

Fs(t) = A exp(- αt) + B     หรือ     Fr(t) = 1 – Fs(t) = 1 – [A exp(- αt) + B]

 

เมื่อ Fs(t) และ Fr(t) คือจำนวนร้อยละของโครงสร้างดีเอ็นเอแบบ supercoil และแบบ relax ตามลำดับ ที่แต่ละช่วงเวลาของการสัมผัส t (ในหน่วยชั่วโมง)  A และ B เป็นค่าคงที่ โดย B คือจำนวนร้อยละของโครงสร้างแบบ supercoil ที่คงที่แล้ว (ช่วงระนาบของเส้นโค้งในรูปที่ 3)   และ A+B คือจำนวนร้อยละของโครงสร้างแบบ supercoil ตอนเริ่มต้นใน control  ส่วน α คือ time evolution coefficient ที่มีแต่ค่าบวก ซึ่งขึ้นกับชนิดของวัสดุนาโนและเงื่อนไขของการสัมผัส โดยถือว่าโครงสร้างแบบอื่นๆของดีเอ็นเอมีน้อยมาก

 

 

รูปที่ 3 จุดทั้ง 4 ชนิดแทนผลเชิงตัวเลขของการวิเคราะห์ในรูปที่ 2 และเส้นโค้งสีแดงแทนผลการทดลองเหล่านี้ด้วยผลการคำนวณจากสมการข้างต้น (เส้นสีแดง)

 

            ค่าคงที่ต่างๆในสมการข้างต้นที่แทนผลการทดลองได้ใกล้เคียงที่สุด ดังแสดงในรูปที่ 3 มีค่าดังต่อไปนี้ A = 37.5 %, B = 36.5 %, αdry = 1/8.7 = 0.115, αwet = 1/3.10 = 0.323 ซึ่งจะเห็นได้ว่า α ของกรณีเปียก (αwet ) มีค่ามากกว่าของกรณีแห้ง (αdry ) ถึงเกือบ 3 เท่า แสดงว่าในกรณีเปียกนั้น ดีเอ็นเอเปลี่ยนโครงสร้างไปรวดเร็วกว่ากรณีแห้งมาก นั่นคือทำให้คิดได้ว่าการทำลายดีเอ็นเอของวัสดุนาโนเป็นแบบโดยตรง ที่ได้รับการสนับสนุนจากสิ่งแวดล้อมที่เปียก ซึ่งอาจทำหน้าที่เป็นตัวกลางเชื่อมต่อระหว่างดีเอ็นเอกับวัสดุนาโนผ่านกระบวนการทางกายภาพ / เคมี / ชีววิทยาบางอย่างเช่น ประจุไฟฟ้า สนามไฟฟ้า อนุมูลต่างๆ หรือ สัญญาณชีวภาพ และอาจเป็นไปได้ด้วยว่า การสัมผัสกันแบบเปียกเปิดโอกาสให้เกิดปฏิกิริยาออกซิเดชันที่อนุภาคนาโนเหนี่ยวนำให้เกิดการแยกน้ำที่ไม่ต้องอาศัยแหล่งพลังงานภายนอกเช่น แสง ความร้อน หรือกระแสไฟฟ้า เราได้พบว่ามีความแตกต่างระหว่างกรณีท่อนาโนคาร์บอนกับแผ่นนาโนทังสเตนไตรออกไซด์อย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งชี้ให้เห็นว่าท่อนาโนคาร์บอนมีความเป็นพิษมากกว่า

 

 

 

รูปที่ 4 เปรียบเทียบเปอร์เซ็นต์การรอดชีวิตและการกลายพันธุ์ของแบคทีเรีย E. coli หลังได้รับการส่งถ่ายดีเอ็นเอแบบที่ได้สัมผัสกับแผ่นนาโนทังสเตนไตรออกไซด์ (ซ้าย) และ แบบที่ได้สัมผัสกับท่อนาโนคาร์บอน (ขวา) นาน 12 กับ 24 ชั่วโมง

 

              พลาสมิดได้ถูกส่งถ่ายเข้าสู่เซลล์แบคทีเรียชนิด E. coli ภายหลังจากการผสมกับวัสดุนาโน ได้สังเกตเห็นการตายและการกลายพันธุ์ของเซลล์ (ดูรูปที่ 4) การตายของเซลล์มีมากถึงประมาณ 90 % ส่วนที่รอดชีวิตก็กลายพันธุ์ไปเกือบทั้งหมด ข้อเท็จจริงของการกลายพันธุ์เกือบ 100 % ในกรณีของการสัมผัสแบบเปียกนี้  ทำให้คิดได้ว่า วัสดุนาโนมีความเป็นพิษมากจนสามารถเหนี่ยวนำให้เกิดมะเร็งหรือโรคอื่นๆที่เกิดจากการที่ดีเอ็นเอถูกเปลี่ยนแปลงได้ ผลของการหาลำดับเบสดีเอ็นเอแสดงให้เห็นว่าการกลายพันธุ์ในระดับเล็กเกิดขึ้นหลังจากที่ดีเอ็นเอไปสัมผัสเข้ากับวัสดุนาโนโดยเป็นการกลายพันธุ์แบบทรานส์เวอร์ชั่น (transversion) เป็นส่วนใหญ่

              การสาธิตเชิงทดลองนี้ได้แสดงให้เห็นอย่างชัดเจนว่า ความเป็นพิษอย่างหนึ่งของวัสดุนาโนคือการทำร้ายดีเอ็นเอโดยตรง ส่งผลให้เซลล์ชีวภาพตายหรือกลายพันธุ์ได้ และอาจ เป็นสาเหตุของโรคบางอย่างเช่น มะเร็ง ผลการศึกษานี้เป็นเสียงเตือนให้มีความระมัดระวังในการบำบัดรักษาด้วยการส่งถ่ายยีนที่ใช้วัสดุนาโนเป็นสื่อกลางเพราะ ยีนที่ได้สัมผัสกับวัสดุนาโนแล้วนั้น อาจเกิดการเปลี่ยนแปลงไปจากเดิมได้ ซึ่งอาจส่งผลให้การรักษาล้มเหลวหรือถึงขั้นผิดพลาดได้

 

รายงานโดย

รองศาสตราจารย์ ดร. เหลียงเติ้ง  ยู

ศูนย์ความเป็นเลิศด้านฟิสิกส์

ตู้ปณ. 70 มหาวิทยาลัยเชียงใหม่ อ.เมือง จ.เชียงใหม่ 50202

E-mail : yuld@thep-center.org